酶这样的大分子常会有好几个溶解度***小点 酶的x射线结晶分析学 x—射线结晶分析学是用x射线衍射手段研究分子在晶体中的三维结构。一个酶结晶的晶体格子中,各个原子排列非常规则,原子周围的电子云经x射线照射后会发生散射,其散射强度将随电子云的密度增加而增加,亦即随原子序数的不同而有变化。这些散射的结果如果收集在底片或磁带上,经过测量和电子计算机的运算,即可算出整个酶分子的三维结构。 结晶的培养 x射线衍射分析需要先培养出体积肥大、形状适当的单晶。以现有的x射线衍射技术,晶体每个方向的厚度不得少于0.2mm。晶形良好但过于细长或扁平的晶体并不适用。 像酶这样的大分子在溶剂中相互间的作用非常复杂,有时甚至难以理解,无法描述。但是结晶的基本原则是怎样能使纯酶的溶液慢慢地达到溶解度***小的状态,从而诱导酶分子在稍过饱和的溶液中,进入晶体格子的适当位置,使分子相互间发生***有利的作用,遂从溶液中结晶出来。 像酶这样的大分子常会有好几个溶解度***小点,随大分子本身的浓度,缓冲液的性质及浓度、pH、温度等因素而定。这可由某些蛋白质会有多晶形同时存在的事实得到证明。而每当我们找到了这样的条件,就可以在酶溶液中加入适量的沉淀剂,使酶结晶出来。为了确保能得到晶形完好的单晶,必须配合各种蛋白质的浓 度,缓冲液的性质,沉淀剂的种类及用量、pH、温度等,以达到***适当的沉淀点。因为涉及的条件太多,譬如pH,有时能不能够得到好的单晶,相差只在0.1上下,所以***初尚有一些原则可循,到了后来,简直是在黑暗里摸索了。有时常要作过几千个试验,才能找到培养酶单晶的***好条件。 又酶分子是柔性的,在溶液中其构象会随环境的变迁而改变,呈不断的运动状态。如何能够使这样的酶分子变得比较稳定,不那么柔软好动,亦即使全体分子更为均质化,以利于晶体的生长,非常难以解决。通常都是加入适当的小分子配体,如经过修饰的底物、辅酶及竞争性抑制剂等。也可以试将酶分子本身加以修饰,以达到目的。 一般都先用悬滴蒸汽扩散法(Hangingdropvapordiffusion)宋搜寻这个能进行结晶的试点。
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