一、荧光硬度计

　　荧光硬度计是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。

荧光硬度计的结构和主要部件

　　（一）光源

　　现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光硬度计普遍采用。

　　超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。

　　新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V），启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。

　　超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节　灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。

　　国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h以上，价格也比较低。

　　
　　 （二）滤色系统

　　滤色系统是荧光硬度计的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的个字母，G是玻璃的个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的个字母，B是玻璃拼音的个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国Corning厂的NO：5-58，即相当于BG12。

　　用于荧光硬度计的主要滤板

1．激发滤板　 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。

　　紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。

　　紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过。

　　紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。

　　大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板激发。

　　近年开始采用金属膜干涉滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。

　　激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光硬度计可选用厚一些。基本要求是以获得明亮的荧光和好的背景为准。

　　2．压制滤板 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：

　　紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。

　　紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红）

　　紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红）
　　
　　 （三）聚光镜

　　专为荧光硬度计设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。

　　1．明视野聚光器　 在一般荧光硬度计上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。

　　2．暗视野聚光器 　暗视野聚光器在荧光硬度计中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。

　　3．相差荧光聚光器　 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。

　　
　　 二、荧光硬度计标本制作要求

　　（一）载玻片

　　载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

　　（二）盖玻片

　　盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本。

　　（三）标本

　　组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。

　 （四）镜油

　　一般暗视野荧光硬度计和用油镜观察标本时，必须使用镜油，好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。

　　三、使用荧光硬度计的注意事项

　　（1）严格按照荧光硬度计出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

　　（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

　　（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。

　　（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，多不得超过2～3h。

　　（5）荧光硬度计光源寿命有限，标本应集中检查，以节　省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

　　（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间 。

　　（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。

　　四、荧光图像的记录方法

　　荧光硬度计所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。

　　荧光硬度计摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光硬度计都有半自动或全自动显微摄影系统装置